Создание определяемых газообразных сред для изучения влияния гипоксии на

Целью данного эксперимента является установка и эксплуатация гипоксической камеры с использованием метода непрерывного потока. Для этого необходимо подобрать и изготовить трубки, колбы и камеры, требуемые для данной процедуры. На втором этапе следует подключить баллон с кислородом и выбрать скорость потока для создания желаемого уровня гипоксии.

Увлажните газ, пропустив его через барботер с деионизированной водой. Подсоедините увлажненный газ к гипоксической камере и поместите исследуемые образцы в камеру для воздействия условий гипоксии. Полученные результаты показывают летальность эмбрионов при гипоксии, зависящую от Hi F1, на основании наблюдения за выживаемостью до взрослого состояния.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими решениями, такими как перчаточные боксы, является простота и дешевизна изготовления в лабораторных условиях, а также обеспечение точной и воспроизводимой концентрации газов в климатической камере. Хотя данный метод позволяет изучить гипоксический ответ у нематоды C elegance, его можно адаптировать и для других систем, включая более крупные модельные организмы и клеточные культуры. Кроме того, он может быть использован для изучения других газов, в том числе диоксида углерода и сероводорода.

В данном протоколе демонстрируется способ конструирования гипоксической камеры. Газ хранится в баллонах со сжатым газом с определенной концентрацией кислорода, к которым присоединен двухступенчатый регулятор. Газ поступает в нижнюю часть проточной трубки и выходит из верхней части с заданной скоростью потока.

Затем газ поступает в барботер, где происходит его увлажнение. После этого увлажненный газ проходит через впускной клапан в камеру гипоксии, создавая условия гипоксии для образцов. В завершение газ выводится в помещение через выпускное отверстие, просверленное в камере.

В качестве корпуса экологической камеры можно использовать чашку для кристаллизации Pyrex или коробку от упаковки стрел. Объем контейнера должен быть минимальным, а материал — газонепроницаемым. Просверлите отверстие в одной из стенок контейнера сверлом с углеродным или алмазным наконечником, затем установите пластиковый штуцер для шланга.

Перемешайте эпоксидную смолу перед нанесением на короб и фитинг. Затем повторите ту же процедуру на противоположной стороне контейнера, расположив второе отверстие со смещением относительно первого. Для усиления турбулентного перемешивания используйте FEP- или нейлоновые трубки с внешним диаметром 1/8 дюйма для соединения баллонов со сжатым газом с устройством управления потоком, таким как регулятор массового расхода или ротаметр.

Газовые баллоны должны иметь определенную концентрацию кислорода, сбалансированную азотом, в соответствии с сертифицированным стандартом для содержания кислорода или для аноксических условий. При использовании чистого азота применяйте двухступенчатый регулятор, установив вторую ступень на требуемое давление. Инструкции по выбору подходящей скорости потока см. в письменном протоколе.

Затем подсоедините трубку от двухступенчатого регулятора к трубке расходомеру, который контролирует скорость потока газа, поступающего в камеру. Выход расходомера соединяют с газопромывным флаконом с пористым цилиндром, содержащим дистиллированную воду. После этого подсоедините трубку с другой стороны промывного флакона к одному из патрубков климатической камеры.

Это обеспечит увлажнение газа, поступающего в климатическую камеру. Используйте вакуумную смазку для герметизации камеры. Затем поместите грузы на крышку камеры, чтобы обеспечить ее полную герметичность.

Проверьте герметичность, приложив небольшое количество воды на ладони в перчатке к патрубку для отвода газа из камеры и проверив наличие пузырьков. Сначала создайте синхронизированные популяции морских Elgan. Поместите от 1 до 100 взрослых особей GR в каплю щелочного раствора гипохлорита натрия на поверхность чашки с не засеянной средой для выращивания нематод.

Дайте раствору гипохлорита натрия впитаться в агар после инкубации в течение не менее восьми часов. Перенесите синхронизированных личинок стадии L1 на чашку с посевом живых бактерий OP 50. В качестве альтернативы, позвольте взрослым особям GRA откладывать яйца на чашку в течение двух-трех часов для получения группы червей, которые будут развиваться синхронно, или отберите личинок стадии L4 из смешанной популяции для сбора молодых эмбрионов.

На стадии двух-четырехклеточного эмбриона с помощью лезвия бритвы измельчите взрослых особей GR в небольшом объеме воды, затем перенесите эмбрионы с помощью ротового дозатора, после чего поместите червей на чашку для воздействия гипоксических условий. Нанесите кольцо пальмитиновой кислоты в этаноле в концентрации 10 mg/mL по краю чашек, чтобы предотвратить уползание червей с поверхности агара.

Пальмитиновая кислота выпадет в осадок. По мере испарения этанола, создающего физический барьер для обеспечения равномерности, обязательно замените воду в газопромывной бутылке перед помещением в климатическую камеру. После переноса червей на чашки герметично закройте их в климатической камере, запустите подачу газа и поддерживайте воздействие в течение необходимого для анализа времени.

Для оценки жизнеспособности эмбрионов до взрослого состояния дайте червям развиваться в течение 48 часов после возвращения в комнатный воздух; к этому моменту они должны достигнуть стадии личинок четвертой стадии или однодневных взрослых особей. Для визуализации червей, подвергнутых гипоксии, перенесите их в каплю среды M9 на квадратное покровное стекло размером 22 мм и, при необходимости, переверните на подушечку из 2% agarose в среде M9.

В качестве анестетика можно использовать 25 мМ амола или 10 мМ азида натрия. В качестве альтернативы, после воздействия гипоксии, прозрачную среду для содержания животных можно поместить непосредственно на предметный столик диссекционного микроскопа. Представлены два ракурса, один из которых включает всю установку для подачи газа.

Второй вариант — только с камерой на предметном столике микроскопа. Вырастите червей штамма Bristol N2 на четырех чашках Петри диаметром 10 сантиметров до тех пор, пока большинство из них не достигнут стадии взрослых особей GR. Перенесите червей в коническую пробирку объемом 15 миллилитров с щелочным раствором гипохлорита натрия в соотношении 1:5 и инкубируйте при перемешивании до начала разложения червей.

Не более пяти минут. Промойте червей трижды в среде M9, центрифугируя при 1 500 ×g после каждой промывки, не вскрывая планшет. Распределите обесцвеченные эмбрионы по восьми 150-миллиметровым чашкам с NGM и дайте эмбрионам развиться до стадии личинок L4 в течение примерно 48 часов.

При температуре 22 °C поместите планшеты в климатическую камеру и подвергните воздействию гипоксических и аноксических условий в течение четырех часов или в течение времени, указанного в плане эксперимента. Для сбора образцов быстро снимите крышку гипоксической камеры. Возьмите один планшет с образцами, снова герметизируйте камеру и зафиксируйте время и этапы выполнения действий.

После извлечения червей из условий гипоксии весь этот процесс должен занять менее двух минут. Используйте дистиллированную воду, чтобы перенести червей на нейлоновый фильтр, а затем перелейте их в маркированную коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 100 µL 1% SDS. Центрифугируйте червей в SDS в настольной центрифуге при 1 500 ×g в течение 15–20 секунд.

С помощью центрифуги используйте вакуум для удаления большей части супернатанта из пробирки, не затрагивая осадок с червями. С помощью пипетки перенесите осадок с червями с определенным объемом жидкости в маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 µL. Если образец предназначен для SDS-PAGE, в пробирку можно добавить равный объем двухкратного буфера для нанесения белков; затем закройте пробирку и погрузите ее в жидкий азот.

Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будут изолированы все образцы. Для обеспечения согласованности следуйте этим же инструкциям при работе с контрольными образцами воздуха в помещении; образцы можно хранить при температуре -20 °C. На этом рисунке показана жизнеспособность эмбрионов, подвергшихся воздействию 1000 ppm кислорода, 5 000 ppm кислорода и условиям нормоксии при концентрации около 210 000 ppm кислорода.

Эмбрионы подвергают воздействию каждого условия в течение 24 часов в камерах с непрерывным потоком кислорода. Червей перемещали в условия нормоксии, где они развивались до взрослого состояния в течение 48 часов, после чего оценивали их жизнеспособность до достижения взрослой стадии. После выполнения этой процедуры можно собрать образцы для последующего анализа с помощью вестерн-блоттинга, QPCR или физиологических тестов, таких как определение продолжительности жизни или продукции потомства.

После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как организовать камеру с непрерывным потоком гипоксической смеси в вашей собственной лаборатории.