DNA Mikroarray'ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

Bu prosedürün genel amacı, otomatik bir karıştırıcı düzenek kullanarak bir mikroarray deneyi gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle RNA amplifikasyonu ve işaretlemesinin ardından RNA örneklerinin kalitesinin bioanalyzer ile analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. RNA örnekleri mikroarray'lere hibridize edilir.

Son olarak, hibridize edilmiş mikro-diziler yıkanır ve taranır. Nihayetinde, çift renkli floresan mikro-dizi görüntülerinin analizi yoluyla RNA transkriptlerinin diferansiyel ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilir. Mikro-dizi hibridizasyon adımlarının uzmanlık gerektiren ekipmanlar nedeniyle öğrenilmesinin zor olması sebebiyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Kalite kontrol analizi, yazılı prosedürde belirtildiği şekilde 2, 100 bioanalyzer cihazının ve çip hazırlama istasyonunun hazırlanmasıyla başlar. Ardından, RNA 6, 000 nano kit santrifüj ile birlikte verilen bir spin filtreye 550 µL pipetlenerek jel matrisi filtrelenir. Filtre, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1, 500 RCF'de santrifüj edilir.

Ardından, filtre edilen jeli, dört °C'de bir aya kadar saklanabilen 65 µL'lik alikotlara ayırın. Boya konsantresini 10 saniye boyunca vorteksleyin ve 65 µL'lik bir alikota bir µL ekleyin. Karışımı vorteksledikten sonra, örnekleri çalıştırmak için filtre edilmiş jeli oda sıcaklığında 13.000 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Öncelikle bir çipi hazırlama istasyonuna yerleştirin. Bu demonstrasyonda, RNA 6,000 nano chipps kullanılmıştır. Siyah arka plan üzerinde beyaz G ile işaretlenmiş kuyuya dokuz µL jel boyası karışımı yükleyin.

Pipet ucu kuyucuğun en altına yerleştirilmiş haldeyken, şırınga pistonunu bir mililitre konumuna getirin ve hazırlama istasyonunu kapatın. Piston, klips tarafından tutulana kadar yavaş ama istikrarlı bir şekilde aşağıya doğru bastırın.

30 saniye sonra klipsi serbest bırakın ve pistonun birkaç saniye yükselmesine izin verin. Piston durduğunda, pistonu tekrar bir mililitre konumuna çekin ve ön hazırlama istasyonunu açın. Dokuz mikrolitre jel boyası yükleyin.

İki kuyucuğun her birinde karıştırın. Mark G'yi işaretleyin. Ardından, işaretleyiciden beş µL'yi merdiven kuyucuğuna ve 12 örnek kuyucuğunun her birine ekleyin. Son olarak, denatüre edilmiş merdivenden bir µL'yi merdiven kuyucuğuna ve denatüre edilmiş her bir örnekten bir µL'yi örnek kuyucuklarına yükleyin.

Son olarak, kullanılmayan her örneğin kuyucuğuna bir µL marker ekleyin. Yükleme tamamlandıktan sonra, çipi 2.400 RPM'de bir dakika boyunca vorteksleyin. 2.100 expert yazılımını başlattıktan sonra, çipi yerleştirin ve kapağı kapatın.

Buharlaşmayı önlemek için doğru portun seçili olduğundan emin olun ve örnekleri yükledikten sonra beş dakika içinde analizle başlayın. RNA amplifikasyonu ve işaretlemesi için uygulanacak yöntemler yazılı protokolde yer almaktadır. İşaretleme tamamlandıktan sonra, bağlanmamış nükleotidleri uzaklaştırmak için cogens r an easy mini kolonlar kullanarak CRNA'yı saflaştırın; ardından işaretli CRNA, NanoDrop 2000 spektrofotometre ile kantifiye edilebilir.

Mikrodizilim ölçüm modunda; örnek konsantrasyonunu, verimi ve spesifik aktiviteyi kaydedin. Mikrodizilim hibridizasyonu için, hibridizasyondan en az iki saat önce en az 825 nanogram verim ve mikrogram başına en az sekiz pikomol spesifik aktivite elde edilmesi gereklidir. Hibridizasyon istasyonunu açın ve 65 °C'ye ayarlayın.

Bu protokol, Roche nimble gen hibridizasyon sistemi ve dört karıştırıcı haznenin, yazılı protokolde açıklandığı şekilde gerçekleştirilen cRNA fragmentasyonunun ardından Agilent 4x40 4K dizileri ile kullanımını açıklamaktadır; hibridizasyon haznesini hazırlayın. Bir mikroarray lamını, barkod tarafı gelecek şekilde montaj-demontaj aracına yerleştirin. Önce bir A4 karıştırıcıyı açın ve diziyi ile montaj-demontaj aracını sabit tutarak herhangi bir hareketi önlemek için yapıştırıcıyı açığa çıkarın.

A dörtlü karıştırıcıyı, en uçtan başlayarak lamın üzerine yerleştirin. Karıştırıcının aletle doğru şekilde hizalandığından emin olun ve karıştırıcıyı dizi boyunca yapıştırın. Lam-karıştırıcı düzeneğini çıkarmak için lamı karıştırıcının ucundan çekin.

Yapışkan contanın lama sıkıca yapışmasını sağlamak için braying aracını kullanarak tüm hat boyunca bastırın. Yapışkan ile lam arasında hapsolmuş küçük hava kabarcıkları koyu arka planda görülebilir. Bu kabarcıkları braying aracıyla gidermek için ekstra zaman ayırın.

Dizi artık yüklemeye hazırdır. Hibritleme örneğinden 100 µL yüklemek için pozitif yer değiştirme pipeti kullanın. Ucu port deliğinin içine sıkıca itin ve hava kabarcıklarının dizi alanında sıkışmaması için yavaşça ve pürüzsüz bir şekilde boşaltın.

Numune tüm diziyi kapladığında ve sıvı havalandırma portundan çıkmaya başladığında, pipeti hızla çekin ancak pistonu sadece serbest bırakın. Uç lamdan uzaklaştığında, numuneyi haznenin kendisinden çekmemeye dikkat ederek her iki porttaki fazla sıvıyı nazikçe kurulayın. Ardından, cımbız kullanarak port deliklerini çıkartmalarla kapatın.

Lamı hibridizasyon istasyonuna yerleştirin ve mesane deliklerinin O halkalarının üzerine doğru şekilde konumlandığını kontrol edin. Bu, hibridizasyon sırasında uygun karışımın sağlanmasını sağlayacaktır. Lam kapağını ve istasyon kapağını kapatın.

İstasyonu karıştırma modu B'ye ayarlayın ve diziyi 65 °C'de 17 saat boyunca hibridize edin. İşlem tamamlandığında, A olarak etiketlenmiş cam kabı bir numaralı yıkama tamponu ile doldurun; kap, montaj sökme aparatını alabilecek ve belirli bir hareket alanı sağlayacak kadar büyük olmalıdır. Tüm yıkama işlemleri cam malzemelerde gerçekleştirilmelidir, çünkü plastikler bileşik sızdırma eğilimindedir ve bu durum dizide yüksek arka plan gürültüsüne neden olur.

Bir boyama kabının içine bir lam rafı ve bir manyetik karıştırıcı çubuk yerleştirin. B olarak etiketlenen bu kabı, rafı örtecek kadar yıkama tamponu one ile doldurun ve kabı oda sıcaklığındaki bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Ayrıca, C olarak etiketlenen boş bir boyama kabına bir manyetik karıştırıcı çubuk ekleyin ve bunu da bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin.

Diziyi hibridizasyon istasyonundan çıkarın ve montaj sökme aracına yerleştirin. Montaj sökme aracını ve lamı bir elinizle karşılıklı taraflardan tutarken, tüm düzeneği bir kap içindeki sıvıya daldırın. Dizi alanini çizmemeye dikkat ederek A4 karıştırıcıyı dikkatlice soyup çıkarın.

Lamı hızla rafa ve B boyama kabına yerleştirin. SCI beş boyası ozona karşı duyarlı olduğundan havaya maruz kalma minimize edilmelidir. Bir dakika boyunca orta hızda karıştırarak yıkayın. C boyama kabını önceden ısıtılmış yıkama tamponu iki ile doldurun.

Lamları aktarın ve bir dakika boyunca yıkayın. Yıkama işleminden sonra, lam üzerinde damlacık kalmasını en aza indirmek için lam rafını boyama kabı C'den çok yavaşça çıkarın. Lamı iki dakika boyunca santrifüjleyerek kurulayın.

Ardından lamı 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve argon gazı ile doldurun; sinyal kaybını önlemek için Molecular Devices marka GenePix 4,000 B tarayıcı ile hemen tarama yapın. Burada insan beyninden izole edilmiş dört RNA örneği yer almaktadır. Tümör dokusu örnek kalitesi, RNA 6,000 çipi üzerinde 2,100 bioanalyzer kullanılarak değerlendirilmiştir.

Dolu ve açık ok uçları sırasıyla 18 s ve 28 S-R-R-N-A türlerinin konumlarını belirtmektedir. RNA bütünlük numarası veya RIN, RNA kalitesinin nicel bir ölçümüdür; yüksek kaliteli Total RNA örnekleri, kalite kontrol amacıyla bir bioanalyzer'da çalıştırıldığında, iki ana ribozomal RNA türüne karşılık gelen yalnızca iki ana pik oluşturmalıdır.

Bazı RNA degradasyonları, ilk ribozomal RNA piki öncesinde bir yayılma (smear) şeklinde görülür ve ciddi derecede degrade olmuş örneklerde 28 S-R-R-N-A piki belirgin şekilde daha düşük olur. Düşük kaliteli RNA, düşük tutunma sürelerinde geniş bir pik veya bir dizi pik şeklinde görülür. Bu durumda, iki ribozomal RNA piki ya çok düşük yoğunlukta olur ya da hiç tanımlanamaz.

Kaliteli diziler, nispeten düşük PMT değerlerinde yüksek sinyal üretmelidir. Transkriptlerin çoğunun, deneysel ve referans örneklerde benzer seviyelerde bulunması beklenir. Gen ifadesindeki yaygın ve kitlesel değişiklikler muhtemelen herhangi bir biyolojik önem taşımayacaktır.

Bu nedenle, dizinin çoğu yeşil veya kırmızıdan ziyade sarı görünmelidir. İyi kaliteli sinyaller ayrıca, dizi görüntüsünün dağılım grafiğinde görüldüğü gibi, sinyal histogramlarının tamamen örtüştüğü bir dinamik aralıkta olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, otomatik bir hibridizasyon cihazı kullanarak mikro-dizi deneyiyle nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.