利用数字微镜装置进行模式化光刺激以研究树突分支点处的整合功能

本实验的总体目标是控制光在时间和空间上的复杂模式，从而用于刺激神经元。实现这一目标的第一步是在显微镜光路中的适当共轭像平面位置放置一个DMD芯片。实验的第二步是使用高强度光源（如激光）对DMD进行正确照明。

该操作流程的第三步是消除相干照明产生的散斑效应。最后一步是集成图形用户界面，以操控DMD芯片。最终结果表明，以往难以实现的实验现在可以通过使用DMD系统进行笼锁神经递质的多位点裂解而相对容易地完成。

大家好，我是 Michael Mohammed，来自马里兰大学神经病学系 Chaman Tang 博士的实验室。今天我们将向您展示一种在光学显微镜下生成复杂消融模式的方法。我们实验室利用该方法研究树突整合功能。

那么，让我们开始吧。本实验方案将演示用于实验神经科学的数字微镜器件（DMD）照明系统的工作原理。DMD 是一种光学半导体芯片，其表面排列有数十万个微小的可动反射镜，构成矩形阵列。每个微镜的位置对应于图像中的一个像素。

每个微镜均可独立控制，以在两种取向之间倾斜。在“关”取向时，光线被导向偏离样本照明光轴的方向；在“开”取向时，光线沿光轴方向传播。

DMD 非常适用于细胞裂解，因为它能够耐受极强的紫外光，像素的“开启”和“关闭”状态之间具有高对比度，并且可在数十微秒内实现两种状态之间的切换。DMD 在生物医学研究中的应用得益于图像处理软件和硬件的广泛应用，以及图像显示领域的商业支持。德州仪器公司（Texas Instruments）以 DLP 探索套件的形式销售模块化组件，提供配套的电子驱动装置，以便将 DMD 适配到显微系统中。

需要理解显微镜光学的基本概念。现代荧光显微镜的基本结构包括成像光路和照明光路，主要由物镜、滤光立方体以及分别用于成像和照明光路的两个独立的管镜组成。

显微镜设计有与标本像平面共轭的位置，位于标本平面处于焦平面的物体在这些共轭像平面上也会呈现清晰对焦。这一概念的推论是，在共轭像平面产生的任何明亮图像也会被清晰地投射到标本像平面上。该策略用于将计算机生成的照明图案投射到标本上。

激光束作为非常明亮的光源，可照亮数字微镜芯片（DMD）上微镜在共轭像平面位置所形成的图案。DMD照明系统的设计取决于光遗传学实验所用的激发光，这类实验利用的是可见光波长范围内的光。照明图案可通过相机光路导入。

因此，DMD 芯片可直接安装在双相机端口模块的两个相机端口之一。相反，对于使用紫外光范围（如解笼化合物裂解）的实验，必须通过落射照明路径引入光线，并需创建一个更易接近的共轭像平面。这是因为成像管镜未设计用于紫外光的透射。

相反，照明管镜用于紫外光传输，在成像方面表现足够良好。DMD 上的每个微镜均可相对于芯片平面在正负 12 度之间切换倾斜角度。根据从计算机接收到的数字输入信号，每个微镜的旋转轴位于其对角顶点方向，与芯片矩形边呈 45 度角。

微镜倾斜方向由芯片正面一角的金色三角形标记指定。微镜的倾斜度决定了入射照明光束的俯仰角和方位角的对准。首先将照明光束的俯仰角设置为偏离DMD芯片垂直轴24度，并将方位角设置为垂直于微镜旋转轴方向，以实现对DMD的照明。

精确的光束准直对高效运行至关重要。用于裂解实验时，使用激光源产生高强度可聚焦光束，以实现快速解笼。

此处采用一种准连续二极管泵浦固体三倍频Nd:YAG激光器，需使用相对高功率的激光，因为仅有小部分激光输出能实际传递到样品上。当使用DMD系统时，需将激光输出耦合入多模光纤，以便于调整其位置和方向，使其沿正确轴线照射DMD，从而解决由相干照明产生的散斑问题。光线通过光学光纤进行传输。

将光纤缠绕在由 pazo 电动光纤拉伸器驱动的装置上，使其以约 40 千赫兹的频率振荡。在每次持续毫秒级的光刺激脉冲期间，光纤的微小拉伸足以使散斑图案发生多次移动，从而有效消除散斑效应。最后，使用紫外显微物镜对光纤输出端的光束进行准直，以照射数字微镜器件（DMD），并通过将 CCD 像素与 DMD 图像软件共定位，实现将各个 DMD 微镜与成像 CCD 相机的特定像素相对应的软件编写。

软件中的图形用户界面允许用户使用计算机鼠标，在图形用户界面上将DMD微镜的方向指定给CCD图像上对应的区域。通过将光标移动到计算机屏幕上显示的图像上来标记光刺激的位置，并单击标记的兴趣区域，以编程设定光传递模式的存储。在计算机屏幕上以一系列独立图像标记的模式，可将每个空间图案对应的激光脉冲时序程序输入软件中。

这将与数据采集程序P clamp集成。最后，使用数据采集程序协调DMD电子器件、激光门控以及来自目标神经元的膜片钳电信号的采集时间。此处展示了光学系统分辨率的校准。

最小光斑尺寸是通过荧光靶标测量得到的。有效生理分辨率通过光电流幅度随光刺激的变化来测定。此处的光斑位置是在直径为两微米的树突分支附近进行光解谷氨酸的照射。

当光斑移动时，垂直穿过微沟槽，展示了不同强度光刺激引发的电反应。图中显示了电压钳制条件下，反应幅度随光刺激强度变化的关系。

使用基于DMD的系统可轻松实现分布式树突刺激。在此实验中，通过增加标记为圆形的光刺激点数量，来调节输入强度，这些刺激点位于两条树突分支上。空间整合作用在分支点之间可能呈现非线性特征。

随着传入两个分支的输入幅度增加，其叠加效应变得越来越显著地超线性。这些结果清楚地说明了跨树突分支点的叠加具有非线性特征。这种超线性效应主要由NMDA受体介导，而非电压门控通道所致。

这可以通过应用两种NMDA拮抗剂PV和MK-801来证明，它们在很大程度上消除了非线性行为。我们刚刚向您展示了基于DMD的神经组织模式光刺激系统的基本设计与操作。该系统可进行改造，以适用于可见光刺激，例如用于光遗传学实验。

它也可适用于单光子裂解所用的近紫外光。进行此操作时，需注意：若使用波长小于400纳米的光源，且大多数情况下通过落射照明路径进行，照明光束的精确对准（误差需在几度以内）至关重要；此外，若使用相干光源，则必须有效消除散斑效应。以上即为全部要点。

感谢观看，祝您的实验顺利。