福尔马林固定及石蜡包埋组织的蛋白质组学样品制备

本实验的总体目标是从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取肽段并进行预分级，以用于蛋白质组学分析。该过程首先通过显微切割分离目标组织，随后进行细胞裂解；第二步是通过样品处理生成肽段。

采用多酶消化滤膜辅助样品制备方法。随后通过测定色氨酸荧光对肽段进行定量。最后一步是利用强阴离子交换剂分离技术对肽段进行分级分离。

最终，制备好的样品可实现对微量样本材料进行深度达 10,000 种蛋白质的蛋白质组分析。与现有的胶内或溶液内消化方法相比，该技术的主要优势在于其适用于激光显微切割细胞等微量临床样本。该方法可提供含有完美且纯净肽段的样品。

是什么推动了人类组织和疾病的蛋白质组学探索？整个方案包含过去开发并发表的技术。这些技术包括高回收率FASP、移液枪头法以及基于色氨酸荧光的肽含量测定，表明该操作流程将具有高效性。

来自我们实验室的技术员卡蒂娜正在准备组织切片，以便进行显微切割。她使用切片机切割样本，切片的厚度取决于样本类型。通常，七到十微米的切片适用于显微切割。

将膜片在紫外光下照射45分钟后，在37摄氏度下干燥两小时前将切片贴附于其上。通过在连续的两个二甲苯容器中依次孵育两个半小时和一个半小时，对贴附的切片进行脱蜡。然后通过连续步骤对切片进行水化。

在无水乙醇中孵育1分钟，70%乙醇中孵育1分钟，最后在水中孵育。用迈耶苏木精染色切片20秒后。

用水冲洗一分钟，然后自然晾干。使用激光捕获显微切割系统收集目标细胞群体。使用Palm仪器时，用3微升组织裂解缓冲液收集粘性帽中的样品，对应10纳升的显微切割组织。

将缓冲液加入盖子中的显微切割材料中，然后盖上管盖。短暂离心后收集悬浮液。随后将显微切割的组织置于加热块中，在99摄氏度下振荡孵育一小时。

将粗提物在16,000 G、18摄氏度条件下离心10分钟以澄清。在超滤装置中，将最多50微升澄清裂解液与200微升UA溶液混合。然后在14,000 G下离心，直至滤膜上残留液体少于10微升。

通常此步骤需要离心10至15分钟。接着，将200微升UA溶液移入超滤装置中并进行离心。与之前相同，在将50微升IAA溶液加入超滤装置前，需先弃去收集管中的滤液。

在室温下，以 600 RPM 的速度在恒温混匀仪中混合一分钟，然后离心。与之前相同，继续按照本视频配套文字方案中所述进行超滤和离心操作。随后将滤过装置转移至新的收集管中。

加入40 µL含有内切蛋白酶Lys-C的消化缓冲液，然后在恒温混匀仪中以600 RPM混匀1分钟。将滤管置于湿室中，37 °C孵育18小时。参照之前的方法离心滤管后，加入160 µL DB缓冲液并再次离心。

滤过单元中流经的是由内肽酶 lic C 释放的肽段混合物。接下来，按照文本方案所述收集三联肽。由于色氨酸残基易于接触溶剂，因此可在稀释缓冲液中测定蛋白质消化产物中的肽含量。为定量肽段，首先用移液器将 0.2 毫升测定缓冲液 DB 加入石英比色皿 Q 中。

然后将石英比色皿放入仪器的比色皿 holder 中，记录空白样的发射光谱。通过向石英比色皿中逐次加入 1 微升色氨酸标准溶液，并用缓冲液 db 轻柔混匀，以 0.1 微克为增量制备校准曲线。清洗石英比色皿后，用移液器加入待测样品，记录样品的光谱。

在进行分级之前，按照文本方案中的描述计算蛋白质和肽段的浓度。通过在普通的 0.2 毫升移液枪头中堆叠六层 EM.Import 离子膜来制备 SAX 小柱。每个样品制备两个 SAX 小柱。

接下来，通过堆叠三层 M four C 18 来制备阶段尖端。在一支 0.2 毫升的移液枪尖中，为每个样品制备六个阶段尖端。开始操作。

使用0.2毫升BRI和Robinson通用缓冲液（pH 11）稀释经ly C消化获得的肽溶液。同样，使用0.2毫升Britannia和Robinson通用缓冲液（pH 5）稀释经胰蛋白酶消化获得的肽溶液。在洗涤和平衡SAX tip柱以及C18固相萃取小柱之前，先将SAX tip柱组装在离心管适配器盖中，具体步骤如文本方案所述。

接下来，在 C18 阶段尖端中组装 SAX 尖端柱。将样品溶液加入平衡后的 SAX 尖端柱中，并以 5,000 G 离心 3 分钟。用 0.1 毫升稀释后的样品洗涤移液尖端柱。

通过在5,000 G条件下离心以促进液体流动。将SAX尖端柱转移至下一个C18阶段尖端，并继续按照文本方案所述洗脱肽段。用0.05毫升缓冲液A洗涤C18尖端柱后，再用0.05毫升缓冲液B将组分洗脱至样品瓶中，后续用于将样品注入配备代表性质谱仪的液相色谱系统。此处展示了蛋白质提取与消化的结果。

裂解250纳升组织（相当于从10微米切片中显微切割出的25平方毫米区域），经快速流程中内肽酶切C和胰蛋白酶连续两步消化后，可获得约45微克总蛋白，蛋白回收率超过50%。图中显示的是肽含量的代表性荧光测定结果，色氨酸标准品与样品的光谱在350至360纳米处均呈现最大吸收峰，荧光强度与色氨酸含量成正比。

观看本视频后，您应充分了解如何利用显微切割技术、样品处理及肽段分级分离方法，从高组织样本中制备用于蛋白质组学分析的样品。掌握该技术后，整个流程可在三至四小时内完成，另需加上蛋白质消化所需的时间。在操作该流程时，务必注意使用新鲜制备的组织切片。该技术的建立，为蛋白质组学领域的研究人员探索组织与细胞的蛋白质组及其在人类疾病中的异常变化提供了途径，尤其适用于福尔马林固定及石蜡包埋的样本材料。