重组蛋白表达、结晶及生物物理研究 芽孢杆菌属保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG

本实验的总体目标是利用非致病性细菌制备重组蛋白，以促进诸如蛋白质X射线晶体学或酶动力学等生物物理化学研究。该方法有助于回答如何利用非致病性细菌制备目标重组蛋白以进行初步生物物理表征的关键问题。该技术的主要优势在于，只要实验室配备细胞培养摇床和分光光度计等常规仪器，即可对目标蛋白进行生物物理表征。

开始此实验步骤时，按照文本方案中所述准备连接反应。用移液器将3 µL已准备好的连接反应液加入含有50 µL化学感受态E.coli DH5 alpha细胞的离心管中。使用移液器轻轻混匀溶液。

将溶液置于冰上 30 分钟。接着，在 42 摄氏度下热激 45 秒。之后，加入 1 毫升 LB 培养基，于 37 摄氏度、250 转/分钟剧烈振荡培养细胞 45 分钟。

将100微升转化后的细胞涂布于含有100微克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上。在37摄氏度下培养18小时。使用无菌枪头从平板上挑取菌落。

在18摄氏度、250转/分钟剧烈振荡条件下，将细胞在3毫升添加了补充物的LB培养基中培养18小时。然后，制备质粒DNA，并按照文本方案中所述确认核苷酸序列。将质粒重新转化至大肠杆菌BL21菌株后，用无菌枪头挑取单克隆菌落，接种于10毫升含有150微克/毫升卡那霉素的LB培养基中。

在37摄氏度、250转/分钟剧烈振荡条件下孵育18小时。随后，将10毫升过夜培养物转移至1升LB和卡那霉素培养基中。在37摄氏度培养，直至600纳米处的光密度达到0.7。

然后将培养物浸入冰水中15分钟。向培养物中加入IPTG，使其终浓度为1毫摩尔。在18摄氏度下继续培养16至18小时。

此后，在 4°C 条件下以 5,000 × g 离心 30 分钟。小心移除上清液。将细胞重悬于 50 µL 含 10 mM 咪唑的 PBS 中。

接下来，按照文本方案中的详细步骤，在冰上裂解细胞两次。在4°C条件下，以25,000 × g离心30分钟，以澄清细胞裂解液。然后，在50毫升锥形管中混合3毫升镍珠和47毫升含有10毫摩尔咪唑的磷酸盐缓冲液（PBS）。

将多余的缓冲液依靠重力流过，使平衡后的珠子沉降于一根2.5 × 10厘米的玻璃层析柱中。使用移液器将上清液转移至该层析柱中。在4°C下于旋转轮上以每分钟20转的速度孵育两小时。

此后，让上清液依靠重力自然流尽。每次使用 100 毫升含 10 毫摩尔咪唑的 PBS 缓冲液，将镍珠洗涤三次。然后，加入 5 毫升含 250 毫摩尔咪唑的 PBS 缓冲液，以洗脱 RBC 1531 蛋白。

按照文本方案中所述，通过 SDS-PAGE 分析 15 微升洗脱液。将收集的组分用移液器转移至透析管中。将透析管置于含有 4 升凝血酶切割兼容缓冲液的烧杯中，在 4 °C 下透析过夜。

第二天，使用移液器将各组分转移至15毫升锥形管中。在280纳米处测定吸光度，以估算蛋白质浓度，具体方法如文本方案所述。随后，将50微升RBC 1531蛋白质转移至多个试管中。

向每支试管中加入不同量的凝血酶，在20摄氏度下孵育3小时。确定所需最小凝血酶量后，向一支15毫升试管中加入10毫克蛋白质和60单位凝血酶。在20摄氏度下孵育3小时。

接下来，将凝血酶消化后的蛋白质转移至离心过滤管中。在4°C条件下以3,000 × g离心，浓缩体积至小于5毫升。随后，将浓缩后的蛋白质上样至预先准备好的尺寸排阻色谱柱中。

每管收集0.5毫升，共收集60个洗脱组分。按照文本方案，将每个组分的15微升上样至15% SDS-PAGE凝胶进行电泳。然后合并含有RBC 1531蛋白的组分。

首先，将合并的组分转移至离心过滤管中。在4°C条件下以3,000 × g离心，将蛋白质浓缩至约18.5毫克/毫升。随后，将每种结晶筛选溶液各50微升加入96孔坐滴结晶板的孔中。

在坐滴板上加入0.5微升浓缩蛋白溶液。另取蛋白溶液与0.5微升储液混合。用透明粘性膜封住板子。

在18摄氏度下孵育，并进行蒸汽扩散。使用光学显微镜，在20至40倍放大倍数下每日观察液滴，监测晶体形成，持续两到三周。制备NTP底物后，将其分别加入96孔板中。

使用移液器将20微克RBC 1531蛋白加入每个孔中并混匀。盖上板盖，于37°C孵育30分钟。随后，将板转移至70°C水浴中15分钟，以终止RBC 1531介导的催化反应。

接下来，向每个孔中加入 1 µL 的酿酒酵母无机焦磷酸酶。在 20 °C 下孵育 30 分钟。然后向反应板中加入 16 µL 钼酸溶液以显色。

15分钟后，在690纳米波长处测定吸光度。本研究在分子水平上对B型严重感染相关基因BC1531的蛋白质产物进行了表征。通过镍亲和层析纯化后，进行凝血酶消化实验。

0.3 单位的凝血酶被证实是完全去除 RBC 1531 亲和标签所需的最低用量。消化后，通过尺寸排阻色谱法将去标签蛋白纯化至约 99% 的纯度。随后，通过尺寸排阻色谱法评估其寡聚状态。

由于RBC 1531在约84毫升处被洗脱，其分子量估计为55千道尔顿。该单体的计算分子量约为13千道尔顿。因此，RBC 1531以四聚体形式组装。

随后采用悬滴蒸汽扩散法进行结晶筛选。在含有1摩尔柠檬酸钠和20%聚乙二醇3,000，或0.1摩尔二甲胂酸钠和1摩尔柠檬酸钠的条件下，两天后观察到晶体。随后测定NTP酶活性。

向RBC 1531介导的水解反应中加入钼酸盐后，未观察到明显的颜色变化。然而，当加入焦磷酸酶后，溶液颜色变为深蓝色。随后通过非线性回归分析690纳米处的光密度与NTP浓度。

RBC 1531 酶的最大反应速率为 0.75，米氏常数为 10 微摩尔。在进行该实验操作时，需及时制备蛋白质样品，并弃去含有任何可能阻碍蛋白质结晶或导致酶学测定误差的杂质的组分。该技术建立后，为酶学及其他蛋白质科学研究领域的研究人员利用大多数实验室中常见的分光光度计来表征目标蛋白质铺平了道路。

尽管该方法可用于了解重组蛋白制备、结晶筛选以及酶动力学的一般原理，但它也可应用于我们感兴趣的其他蛋白质的生物物理化学分析。操作蛋白质时务必小心谨慎，因为它们可能极不稳定。建议采取一些预防措施，例如将样品置于冰上操作，并在长期储存时于 -80 °C 条件下冷冻保存。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用非致病性细菌制备重组蛋白，以获得用于X射线晶体学结构解析的蛋白晶体，以及如何使用比色法对酶活性进行表征。