自下而上与鸟枪法蛋白质组学鉴定耳蜗全面蛋白质组

以下实验的总体目标是利用多种蛋白质组学技术，从成年小鼠耳蜗感觉上皮中获得尽可能多的蛋白质鉴定结果。首先分离成年小鼠的耳蜗感觉上皮组织，然后在裂解缓冲液中进行超声处理以提取蛋白质。随后，对全裂解液或组分分离后的蛋白质裂解液采用不同的消化策略，以提高肽段和蛋白质序列的覆盖度。

接下来采用多种不同的分离技术，包括强阳离子交换和反相色谱，以在质谱分析前降低样品复杂性。结果表明，通过使用多种蛋白质组学方法和高分辨率质谱仪，可鉴定出小鼠耳蜗感觉上皮中大量膜蛋白和可溶性蛋白。该技术相较于现有的抗体微阵列和双向凝胶电泳等方法的主要优势在于，能够同时鉴定出大量可溶性和膜蛋白，从而扩展了耳蜗蛋白质组的数据。

尽管该方法可为与听力和泪液分泌功能障碍相关的生物标志物提供研究线索，但也可应用于其他系统，例如与年龄以及乳腺癌或肺癌相关的生物标志物的鉴定。该方法还可用于研究其他生物样本，如血液。我们在开展此实验之前，最初提出该方法的设想是基于观察到哺乳动物内耳中可用的蛋白质组学数据集十分有限，特别是已鉴定的膜蛋白数量极为有限。

从出生后第30天的小鼠中分离耳蜗感觉上皮组织。用1×磷酸盐缓冲液洗涤组织后，向组织中加入100微升裂解缓冲液，将混合物置于冰上，使用超声破碎仪超声处理30秒。每次超声后将裂解物在冰上冷却1分钟，共重复超声处理三次。

在4°C条件下，以16,000 × g离心5分钟，使悬浮液沉淀。离心结束后，保留上清液用于后续消化。随后，将30微升耳蜗蛋白提取物直接加入30 K超滤离心管中，并与200微升含8摩尔尿素的Riss HCl缓冲液混合。

在14,000 ×g 条件下离心15分钟。离心结束后，用200 µL 8 mol/L尿素溶液稀释浓缩物，并在相同条件下重复离心。接着，向滤器中的浓缩物加入10 µL 10×碘乙酰胺和90 µL 8 mol/L尿素溶液，涡旋混匀1分钟。

将离心过滤器放入微量离心管架后，在避光条件下室温孵育20分钟，随后在14,000 × g 条件下离心10分钟，加入终浓度为每微升0.1微克的内肽酶ly C（酶与蛋白质质量比为1:50），并将混合物在30摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，向滤膜单元中加入40微升100毫摩尔的碳酸氢铵溶液，并在14,000 × g 条件下离心10分钟。重复上述步骤后，用40微升8摩尔的尿素溶液洗涤滤膜单元。随后用40微升超纯水洗涤滤膜单元两次。

用100微升50毫摩尔的碳酸氢铵溶液将滤膜装置清洗三次后，按照酶与蛋白质1:100的比例加入浓度为0.4微克/微升的胰蛋白酶，于37摄氏度孵育过夜。孵育结束后，加入40微升50毫摩尔的碳酸氢铵溶液至滤膜装置中，以14,000 × g离心10分钟，洗脱胰蛋白酶解肽段。随后重复此步骤一次。

此时，将 50 至 100 微克的消化后蛋白质样品注入一根 200 × 2.1 毫米、5 微米的强阳离子交换柱。为分离肽段，在 280 纳米处监测肽段组分，并以每 2 分钟为间隔收集组分。使用馏分收集器收集后，将各组分在真空浓缩仪中干燥。完成后，将干燥的组分于 -80 °C 保存，直至用于液相色谱分析。

串联质谱分析。另一种方法中，采用无凝胶分馏技术分离蛋白质混合物。当耳蜗蛋白质上清液通过丙酮沉淀法完成脱盐后，向此前悬浮于112微升Milli-Q水中的脱盐蛋白质中加入30微升5倍上样缓冲液。

接下来，加入 8 µL 1 M 的 DTT，将混合物在 95 °C 下加热 5 分钟，以还原蛋白质的二硫键。加热后，使混合物冷却。向阳极储液槽中加入 8 mL 电泳缓冲液，向样品收集室中加入 150 µL 电泳缓冲液，向阴极储液槽中加入 6 mL 电泳缓冲液。

加样后，使用8%的Tris醋酸凝胶盒（质量范围为3.5至150千道尔顿），将150微升耳蜗蛋白混合物加入样品上样室。运行开始后，利用移液器在仪器每次暂停时从样品收集室收集样品，并加入新标记的微量离心管中。随后用150微升运行缓冲液清洗收集室两次，并弃去废液。

将不含凝胶的组分进行一维凝胶电泳后，将每个单独的组分直接加入30 K滤膜离心管中。然后在每个滤膜管中加入200微升含8摩尔尿素的Tris-HCl溶液，于14,000 × g离心25分钟。离心后，在每个滤膜管的浓缩物中加入10微升10倍稀释的碘乙酰胺尿素溶液，并涡旋混匀1分钟。

将离心过滤器放入微量离心管架后，将样品在室温下避光孵育30分钟。接着，在30摄氏度下过夜孵育后，按1:50的酶与蛋白比例，向过滤单元中加入浓度为0.1微克每微升的LY C；然后向离心过滤器中加入40微升100毫摩尔每升的碳酸氢铵溶液，并在重复上一步操作一次后，于14,000 × g离心10分钟。随后，用100微升50毫摩尔每升的碳酸氢铵溶液洗涤离心过滤器三次。最后一次洗涤后，按1:100的酶与蛋白比例，加入浓度为0.4微克每微升的胰蛋白酶。待样品在37摄氏度下过夜孵育后，通过向每个过滤单元中加入40微升50毫摩尔每升的碳酸氢铵溶液洗脱肽段，并在14,000 × g离心10分钟。

重复此步骤一次后，采用液相色谱-串联质谱法分析样品。共使用了两种双重消化程序。第一种为三重消化，随后进行第二次胰蛋白酶消化，将消化产物在强阳离子交换柱上分段收集，分为18个组分，再通过纳米液相色谱-串联质谱法进行分析。

采用单次运行的液相色谱串联质谱分析，在1%错误发现率（FDR）条件下共鉴定出1,485种蛋白质。在所鉴定的蛋白质中，分别有324种和258种被归类至线粒体和质膜。

第二次双重消化过程包括先进行lys C消化，随后进行胰蛋白酶消化。每次消化产物分别上样并用强阳离子交换柱分离为18个组分，然后通过纳米液相色谱-串联质谱进行分析。LY C消化与胰蛋白酶消化的结果共鉴定出3,503种蛋白质，错误发现率（FDR）为1%。

此外，分别有605种和617种蛋白质被归类至线粒体和质膜。该方法获得了最多数量的膜相关蛋白质鉴定结果。对LY C和胰蛋白酶进行的重复分析。

各组分显示，鉴定出的蛋白质中有超过65种在不同实验间是共有的。然而，在重复分析中也鉴定出了一些新蛋白质。这些额外的肽段和蛋白质的鉴定是由于色谱条件的微小变化，从而导致了用于碎裂的不同肽段。

制备银染凝胶以显示无凝胶分级分离的结果，如图所示。该凝胶显示了每个连续组分中蛋白质按分子量递增进行分离。因此，对12个无凝胶液体组分采用两种不同的多维度消化方法进行消化，并通过液相色谱-串联质谱法进行分析。

第一种消化方法采用双次胰蛋白酶消化，进行单次液相色谱-串联质谱分析后，在1%错误发现率（FDR）条件下鉴定出2,165种蛋白质。本实验中，分别有516种和399种蛋白质被归类至线粒体和质膜。第二种消化方法采用内肽酶ly C消化，随后进行胰蛋白酶消化和单次液相色谱分析。

串联质谱分析鉴定了 2,211 种蛋白质，错误发现率（FDR）为 1%。该方法鉴定出的膜结合蛋白数量与使用胰蛋白酶-胰蛋白酶方法的结果相似。质谱蛋白质组学数据已提交至 ProteomeXchange 联盟，数据集标识符为 PXD000231。在实施该实验流程时，需注意在每一步骤中避免污染，并在进行蛋白质提取时始终将组织置于冰上，以防止蛋白质降解。