使用智能Leginon实现跨多个载网的冷冻电子显微镜筛选自动化

在西蒙斯电子显微镜中心，我们的目标是为本地和全国的研究人员提供卓越的电子显微镜服务、专业知识和培训，并开发创新方法以优化工作流程。我们的研究范围涵盖服务、技术开发、机器学习以及生物医学研究。我们致力于回答一个问题：如何更好地优化我们的服务？

机器学习正在改变电子显微镜领域。数据采集正变得自动化，数据分析工具也正在迅速变得更加高效。

这包括图像去噪、颗粒挑选、3G柔性分析以及模型构建。我们定期更新软件以应对不同情况，例如不同的网格孔、倾斜采集，或通过在生产环境中对软件进行β测试所发现的漏洞。我们还整合了用户的反馈，因此我们持续提供对他们有用的功能。

Smart Leginon 解决了在冷冻透射电镜上筛选一个或多个载网时费力且耗时的问题。它使操作人员和研究人员能够更快地筛选和分析载网，同时腾出时间并行优化载网和样品条件。这还能减少显微镜的使用时间和成本。

Smart Leginon Autoscreen 提供完全无人值守的多网格筛选功能，设置12个网格的筛选仅需约10分钟。与手动筛选相比，本方案每天可节省数小时时间。自 Smart Leginon 推出以来，已有其他免费及商业软件被开发用于实现类似的自动化功能。

首先，设置 Leginon 界面，然后导航至“Application”（应用程序）并点击“Run”（运行）。在“Run Application”（运行应用程序）窗口中，选择 Ptolemy 应用程序，将主程序设为 Leginon 计算机，将显微镜和相机设为对应的计算机。接着在预设管理器中导入预设参数。

在“方格定位节点设置”中，确保同时选中“按最短路径排序定位目标”和“启用自动定位”。在“方格节点设置”中，确认已勾选“等待节点处理图像”。如果尚未包含，请将“方格预设”添加到列表中。

在高级设置中，勾选“成像时设置这些孔径”并确保孔径值正确。要调整孔定位节点设置，请勾选“允许用户验证所选目标”。取消勾选“排队处理目标”和“跳过自动寻孔功能”两项。

在孔位节点设置中，勾选“等待节点处理图像”，并确认右侧列表中包含孔位预设。在高级设置中，勾选“成像时设置以下孔径”，并确认孔径数值。在曝光目标节点设置中，选择“允许用户验证所选目标”。确保取消勾选“排队目标”和“跳过自动孔位查找”选项。

配置曝光节点设置时，确保取消勾选“等待节点处理图像”选项。确认曝光预设已包含在右侧列表中。在高级设置中，选择“成像时设置以下光圈”，并验证光圈值准确无误。

在焦点节点设置中，确保取消勾选“等待节点处理图像”选项。确认右侧列出了自动对焦预设，并将期望的自动对焦精度设置为 4 × 10⁻⁶ 米。在焦点节点对焦序列中，仅启用双束倾斜自动对焦步骤。

调整Z轴聚焦节点设置时，确保取消勾选“等待节点处理图像”。确认右侧列出的是Hole预设，并将期望的自动对焦精度设置为5 × 10⁻⁵米。在Z轴聚焦节点的对焦序列中，仅启用两个低倍率的载物台倾斜步进。

确定网格Z高度并采集图谱后，在Ptolemy中使用方形靶向节点定位方格。观察每个方格上的蓝色圆圈。将鼠标悬停在每个斑点上，查看Ptolemy计算出的其大小，并记录最大和最小斑点的尺寸。

要修改阈值设置，请调整最小和最大滤波范围，以包含理想的方格并排除不理想的方格。点击顶部工具栏上的“精细方格”按钮。微调滤波范围，直到“精细方格”功能能够有效定位目标方格。

在采集设置中，为最大目标数和采样目标组数选择适当的数值。参数满意后，点击播放按钮继续。然后使用孔定位节点中的标尺工具测量孔的直径。

在模板设置中，确保将测得的直径输入至最终模板直径，然后点击测试。调整直径值，直到所有孔的中心均显示明亮的白色峰值。在阈值设置中点击测试。

调整A值，直至二值化图像仅在孔洞位置清晰显示白色区域。在“斑点设置”中，使用标尺测量距边缘的最小距离，并输入该值以排除边界目标。根据大小、圆度及期望的数量对斑点进行筛选。

将鼠标悬停在斑点上可查看其数值，点击“测试”以查看当前设置。在晶格设置中输入孔的半径及孔之间的间距。然后点击 42 按钮，以测量真空区域的参考强度值。

在采集设置中，勾选“使用采集目标的子集”，并将样本最大值设为较小的数值，例如 2。设定冰层厚度均值及其标准差的较宽范围。使用测试定位，根据上述数值随机选择目标。

所有设置满意后，点击播放按钮继续。在孔设置中，将Shell脚本设置为Ptolemy安装目录下的hl.finding.sh脚本路径。

将最小孔径设置为小于零。输入孔的半径，然后点击“显示数值”按钮，以测量真空区域的参考强度值。

单击“测试”以找到孔的晶格。在采集设置中，勾选“使用采集目标的子集”，并将样本最大值设置为较小的数值，例如 4。设置较宽范围的冰层厚度均值和标准差。

当确认所有设置无误后，点击播放按钮。Leginon 将执行同心聚焦并采集高倍图像，这些图像可在曝光节点中查看。检查下一张目标曝光图像，以确认设置是否合适。

确认无误后，在曝光目标定位和孔目标定位设置中取消勾选“允许用户验证选定目标”。网格完成筛选后，单击“文件”，然后选择“退出”以关闭 Leginon。要设置 Smart Leginon Autoscreen，请运行 smartlegenionautoscreen。

在终端窗口中选择 GY，并输入以逗号分隔的网格槽位列表到屏幕。然后为工作流程输入 full。为新会话输入模板会话名称以及模板会话的 Z 轴高度值。

将打开一个 GY 界面，用于输入会话名称并为每个网格选择项目关联。之后可让显微镜无人值守，或在 Leginon、Appion 及显微镜计算机上进行监控。