福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀免疫组织化学对照的标准化处理

具有明确蛋白质或转录本表达水平的、经过充分表征的阳性和阴性细胞沉淀对照对于开发免疫组织化学检测方法至关重要。本方案描述了制备和处理福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀对照的过程。此类对照可用于在开发新的免疫组织化学检测方法时鉴定结合特异性。

免疫组化（IHC）检测对于我们在各个治疗领域的发现和生物标志物开发工作至关重要，而开发经过验证的对照是建立这些检测方法的关键。在将基于羟乙基琼脂糖的凝胶加入细胞沉淀之前，必须将其加热至至少40摄氏度。在凝胶凝固之前，必须将其与细胞充分混匀。

通过向3毫升细胞沉淀中加入30毫升10%中性缓冲福尔马林溶液，使固定液与细胞的比例达到10:1，开始对293T细胞沉淀进行固定。将50毫升离心管盖紧后反复倒置，使细胞充分重悬，并于室温下静置过夜使其沉淀。为提高固定效果，次日再次倒置离心游戏副本并重悬细胞，以增大表面积与体积的比率。

固定24小时后，在5°C条件下以930 × g离心10至15分钟。确保可见细胞沉淀，通过倾倒或使用无菌移液管小心吸除固定液。将40至60°C的熔融羟乙基琼脂糖凝胶以1:4的凝胶与细胞沉淀比例加入沉淀中。

使用一根洁净的5英寸、2毫米尖端的纯银探针，探针前端用自来水冲洗，轻轻搅拌50毫升锥形管中的内容物，使固定后的细胞在底部熔融凝胶中均匀悬浮。待固定细胞在熔融凝胶中均匀悬浮后，盖紧锥形管，置于湿冰上5至10分钟。待凝胶沉淀物完全凝固后，将一把洁净的微型刮勺沿管壁小心插入，轻轻撬动沉淀物，注意不要刺穿。

将凝固的沉淀物置于活检纸上。使用洁净的微型刮勺，将细胞沉淀切成四到五毫米厚的片状，以适配26毫米×26毫米×5毫米的组织包埋盒。将单个凝胶沉淀片置于一片活检纸的中央。

将相对的两侧折叠，并在将切片放入26 × 26 × 5毫米的组织包埋盒前用纸包裹。盖上盖子。将修整好的细胞沉淀包埋盒放入盛有10%中性缓冲福尔马林的组织处理仪反应罐中，并按短程序运行处理。

包埋细胞沉淀时，将处理好的包埋盒放入包埋中心的放置区。打开组织包埋盒盖，小心展开活检纸，将细胞沉淀放入一个15 mm × 15 mm的一次性包埋模具中，切面朝下。

用镊子轻轻固定模具底部的细胞沉淀，将62摄氏度的组织浸润或包埋石蜡加入模具中，完全覆盖细胞沉淀。将模具移至冷台以使石蜡凝固。在石蜡凝固过程中调整细胞沉淀的位置，并将其固定在模具底部的适当位置。

打开包埋盒盖子，将包埋盒底部朝下放置在包埋模具上，并加入额外的熔融石蜡以覆盖包埋盒。当石蜡完全填充组织包埋盒后，将模具放回冷台进行凝固。

使用旋转式切片机将石蜡切片从漂浮浴中拾取，并转移至带正电荷的载玻片上。将第一张切片置于盖玻片和染色边界范围内的载玻片顶部位置，随后将后续切片依次自上而下排列放置。完成后，先于23°C条件下干燥24小时，再于60°C条件下干燥30分钟。

采用此方法制备的包埋细胞团块在切片中显示出均匀的细胞分布，团块内细胞聚集和相互作用极少。当使用棕色二氨基联苯胺显色剂进行免疫染色时，可在细胞核内观察到三种细胞系中TEAD转录因子表达水平的差异，从无表达、弱表达到强表达不等。将细胞团块整合到微阵列中，可在同一张载玻片上对不同表达水平的对照样本进行评估，且实验操作条件保持一致。

如本示例所示，可观察到PEG10缺陷型小鼠胚胎干细胞的阴性对照以及过表达PEG10的293T细胞的阳性对照。确保细胞充分固定并在凝胶沉淀物中均匀分布，可建立均一且标准化的检测对照。这些细胞沉淀物可用作后续免疫组织化学和NC2杂交实验的对照，结合标准的抗原修复和标记方法进行操作。

细胞沉淀对照已推动了许多免疫组织化学检测方法的发展，特别是针对新发现或研究较少的蛋白质。它们可作为明确定义的对照，有助于表征抗体的特异性。