利用热 shift 测定法探究底物与硒蛋白 O 的结合
2024年8月9日
本文介绍了热位移分析法，这是一种高通量、基于荧光的技术，用于研究小分子与目标蛋白质的结合。
我们的目标是研究功能未知蛋白质的生物化学活性。辅因子的结合不仅对某些蛋白质的活性至关重要，还可能改变其热稳定性。这一现象的一个实际应用在于利用蛋白质熔点温度所测得的热稳定性变化，来分析配体结合情况。
热位移分析是一种多功能工具，可用于研究蛋白质与潜在辅因子或药物的相互作用，并用于确定适合晶体学研究的稳定条件。与其他筛选方法相比，该方法具有设置相对简单、通量高的优势，可使用96孔或384孔板进行。硒蛋白O（Selenoprotein O，简称SelO）是一种在进化上保守的假激酶，能够将腺苷一磷酸从ATP转移至蛋白质底物，这一过程称为AMP化修饰，属于翻译后修饰的一种。在本实验方案中，我们利用热位移分析（TSA）来研究SelO对核苷酸和金属离子的结合特性。
首先，使用热迁移分析（TSA）缓冲液配制 SelO 蛋白溶液。将蛋白、小分子化合物和 SYPRO Orange 染料分别加入 384 孔板的相应孔中。用光学透明的粘性封膜覆盖孔板，并在离心机中以 1000g 离心一分钟，短暂离心收集液体。
然后将反应板放入实时荧光定量PCR仪中，设置程序为：20摄氏度保持2分钟，随后每分钟升高0.5摄氏度，直至95摄氏度。从实时荧光定量PCR仪导出相对于温度的相对荧光单位（RFU）数据。使用选定的软件，提取每条熔解曲线中荧光强度达到最高值之前的数据点并进行绘图。
通过Boltzmann S型拟合数据确定熔解温度（Tm）。热变性曲线显示，在存在ATP和镁离子的情况下，大肠杆菌SelO的热稳定性提高了4摄氏度，而在ATP和锰离子存在时则提高了12摄氏度。然而，在与UTP孵育时，热稳定性未发生改变，表明大肠杆菌SelO可能无法与UTP发生可检测的结合。无蛋白以及无染料的对照组荧光信号较低，且不随温度升高而变化。
概述
本文介绍了热迁移实验（TSA），这是一种基于荧光的高通量技术，用于研究小分子与蛋白质的结合。TSA 特别适用于分析配体结合以及确定晶体学所需的稳定条件。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质相互作用
- 热稳定性分析
背景
- 辅因子结合对某些蛋白质的活性至关重要。
- 热稳定性变化可指示配体结合。
- 蛋白质的熔解温度是热 shift 测定（TSA）中的关键测量指标。
- 硒蛋白 O（SelO）是一种参与 AMP化修饰的假激酶。
研究目的
- 研究功能未知蛋白质的生物化学活性。
- 利用热迁移分析（TSA）检测SelO与核苷酸及金属离子的结合。
- 确定适用于蛋白质晶体学的稳定条件。
使用的方法
- 热 shift 测定（TSA）
- 基于荧光的检测
- 使用 96 或 384 孔板的高通量筛选
- 通过热稳定性变化分析配体结合
主要结果
- TSA 可有效检测配体与蛋白质的结合。
- 分析了 SelO 与核苷酸及金属的相互作用。
- 热稳定性变化与配体结合相关联。
- 该方法相较于传统筛选技术展现出优势。
结论
- 热迁移实验是研究蛋白质相互作用的多功能工具。
- 它可提供关于蛋白质生物化学活性的信息。
- 热迁移实验有助于为晶体学研究确定蛋白质的稳定条件。
常见问题
行业重要性概述
热移位分析（TSA）能够快速、高通量地评估配体结合与蛋白质稳定性，直接支持生物制药研发中早期靶点验证和机制性风险排除。通过定量分析硒蛋白O与底物及辅因子的相互作用，TSA为功能注释以及为后续结构研究确定稳定条件提供了依据。该方法在发现流程的关键转折点上增强了预测的可信度，尤其适用于此前功能未知的蛋白质。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接检测配体和辅因子与未表征蛋白质的结合情况。
- 通过揭示底物特异性和结合依赖性，支持机制层面的风险评估。
- 通过定量的热稳定性变化，促进功能靶点的验证。
- 为新型蛋白质靶点组合的筛选提供可操作的数据支持。
筛选与检测方法开发
- 通过基于微孔板的高通量筛选，可同时检测多种配体条件。
- 利用定量熔解温度测定，实现检测结果的标准化。
- 支持对蛋白质-配体相互作用进行可重复评估，以确保检测的准备就绪性。
- 有助于确定结构与功能研究中的最佳实验条件。
转化与临床前研究
- 当底物特异性明确时，将生化研究结果与疾病相关的蛋白质功能关联起来。
- 为新靶点提供从发现到临床前验证的连续性支持。
- 通过早期阐明分子机制，降低后期研发失败的风险。
流程与工作流整合
TSA 位于早期发现与先导物识别的交汇点，能够实现以假设为驱动的靶点验证，并支持下游的检测开发和结构生物学工作流程。
- 发现生物学： 定量分析配体结合及辅因子需求，以阐明蛋白质功能。
- 筛选： 提供可扩展且可重复的输出结果，用于化合物和实验条件的评估。
- 分析： 生成不同实验条件下的熔解温度数据，用于比较分析。
- 转化研究： 在适用情况下，将生物化学表征与临床前模型选择相衔接。
- 企业级应用： 提供一个广泛适用的平台，适用于多种蛋白质靶点和配体类别。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点选择的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：简化检测建立流程，增强可重复性，并支持高通量工作流程。
- 战略价值：通过明确靶点-配体关系，改善“推进/终止”决策及资本配置。
- 项目组合影响：基于定量结合数据，实现对新型靶点的风险校正优先排序。
实施注意事项
- 需要具备蛋白质生物化学和基于荧光的检测方法设计的专业知识。
- 需要配备实时PCR仪或兼容的热循环仪和酶标仪。
- 要求采用标准化操作流程，以确保不同团队间的可重复性和数据可比性。
- 针对不同蛋白质类别或配体类型可能需要进行方法优化。
- 依赖于蛋白质的纯度和稳定性，以获得可靠的测量结果。
