用于原位纤维束表面接枝的人工肺装置预处理

用于重症监护的血液屏障类医疗器械常面临血栓形成问题，这会损害器械功能并增加全身性血栓风险。临床抗凝药物虽可减轻血栓形成，但会增加出血风险。生物材料表面的蛋白质吸附会触发凝血和炎症反应。

我们研究了zoura聚合物清洗涂层对ECMO管路蛋白质吸附的影响。目前尚无商业化的抗凝剂能够选择性且有效地抑制医疗器械中的血栓形成，同时不影响患者自身凝血功能。此外，针对各类医疗器械，必须优化并验证表面涂层与工程化处理在数天至数周甚至数月时间范围内的有效性。

我们的新科学目标包括：评估不同预处理方法对涂层应用的影响，考察清洗过程中处理涂层溶液的方式对涂层均匀性的影响，研究替代性防污聚合物接枝对非特异性蛋白质污染的作用，以及确定优化后的涂层在体内限制血栓形成的能力。为清洗肺循环回路，先用含30%甲醇的去离子水循环清洗20分钟，随后用含10%甲醇的去离子水循环清洗，最后再用去离子水单独循环清洗20分钟。

用设定为低流速的过滤室内空气干燥肺循环系统两小时。将清洁并干燥后的肺循环系统放入紫外臭氧等离子体发生器中。关闭发生器并启动仪器，进行20分钟的等离子体处理。

完成等离子体处理后，应立即进入包被步骤，以防止表面链重排以及等离子体作用产生的活性位点丢失。在装置进行表面修饰的同时，将1.2克盐酸多巴胺溶解于600毫升三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液中，置于玻璃烧杯内。随后，按1:15的摩尔比将磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯单体溶解于上述溶液中。

然后将五毫摩尔的高碘酸钠以液滴形式加入包被溶液中。使用磁力搅拌子和设定为150转/分钟的搅拌板充分混合溶液。接下来，使用大号注射器抽取并填充管路，以包被溶液对肺部装置进行预处理。

夹住管路的一端，并从另一端进行预充，同时通过管路通路连接器引导出气泡。待管路完全预充后，将装置置于紫外光源下照射两小时。每10分钟上下翻转预充装置的两端，以搅动溶液。

光照处理后，将管路中的液体完全排出。使用60立方厘米的注射器，用去离子水反复灌注并排空，轻轻冲洗所有样品，直至冲洗流出液变澄清。最后，将装置充满去离子水，置于4°C的冰箱中保存，以备后续解剖及表面分析。

进行纤维蛋白原吸附实验时，将纤维膜样品转移至含有1毫升浓度为3毫克/毫升纤维蛋白原溶液的孔板中，在37摄氏度、60 RPM条件下孵育90分钟。用PBS洗涤样品，将其转移至新的孔中，并向每孔加入1毫升浓度为1毫克/毫升的BSA溶液。

再孵育90分钟。然后用PBS溶液将样品洗涤三次，并转移至新的孔中。接着，向每孔加入1毫升PBS溶液中按1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的纤维蛋白原抗体。

将样品孵育30分钟后洗涤，转移至新的孔中。在新孔中，每隔30秒加入500微升含0.03%过氧化氢的邻苯二胺柠檬酸盐磷酸盐缓冲液，调节pH至5.0。将样品避光孵育30分钟。

为了终止过氧化物酶和邻苯二胺的反应，向每个孔中加入500微升1摩尔/升的盐酸。将每个孔中的上清液转移至比色皿中。使用紫外-可见分光光度计在492纳米处测定上清液的吸光度。

将乳酸脱氢酶检测试剂盒解冻20分钟。在试剂盒解冻的同时，准备混合的成人人血浆以获得富血小板血浆。制备富血小板血浆时，将解冻的人血浆样本管在483 G条件下离心，使血浆分离为两个区域。

识别含有富血小板血浆的下三分之一部分和含有贫血小板血浆的上三分之二部分。小心移除试管底部的血小板沉淀以及上三分之二含有贫血小板血浆的部分。通过轻轻摇动试管，将血小板沉淀轻柔地分散到上层血浆中。

检测前，向富血小板血浆中加入氯化钙，以逆转柠檬酸盐的作用。接着，将纤维膜样品置于500 µL富血小板血浆中，在37°C孵育90分钟。孵育结束后，将样品转移至新的孔板中，并用PBS溶液冲洗三次。

再次将样品转移至新的孔中。向每孔加入 300 微升 PBS 溶液和 10 微升 10 X 裂解缓冲液。将样品孵育 45 分钟，然后向每孔加入 50 微升反应混合液，并避光孵育 30 分钟。

每孔加入 50 µL 盐酸以终止反应。为检测吸附血小板裂解物中乳酸脱氢酶的活性，在 490 nm 和 680 nm 波长下测定各孔溶液的光吸收值。与未包被的对照组相比，编码的 PP-PDMS 纤维显著减少了纤维蛋白原污染。

在无流动条件下，PP-PDMS纤维的外层束与内层束之间的纤维蛋白原污染无显著差异。在持续24小时PBS流动条件下，PP-PDMS纤维外层束和内层束的纤维蛋白原污染均保持在较低水平，且无显著差异。血小板污染在PP-PDMS纤维的外层束中高于内层束和未涂层对照组。

与未暴露于流动条件下的内层束相比，外层束的血小板污损显著更高。在24小时PBS流动条件下，外层束与内层束之间的血小板污损无显著差异，且污损水平均较低。