通过液相色谱结合蒸发光散射检测器测定脂质纳米颗粒RNA递送系统中的四种组分

我们的研究聚焦于色谱-质谱联用技术在核酸、肽蛋白及循环肿瘤DNA（CDT）领域的应用。本实验的难点在于脂质纳米颗粒（LNP）多种组分的分离，以及对浓度差异显著的组分进行检测和残留问题的分析。该方案的优势在于实现了良好的分离效果、宽线性范围，并以较低成本实现了对LNP的准确定量。

首先，搭建一套高效液相色谱（HPLC）系统，并配备蒸发光散射检测器。按照色谱柱上的箭头方向安装色谱柱，一端连接自动进样器出口，另一端连接蒸发光散射检测器入口。

配制A相时，准确量取1,387微升三乙胺，转移至1000毫升水中并充分溶解。混匀后，用乙酸调节pH至7。配制B相时，将1,387微升三乙胺溶解于1000毫升甲醇中。

充分混匀，并用乙酸将pH值调节至7。将A相和B相放入托盘中。启动LabSolutions软件并打开实时分析窗口。

单击“文件”，选择“新建”以创建一个新的方法文件，将液相色谱的停止时间修改为15分钟，然后单击“全部应用”以应用于所有采集时间。接着单击“泵”，修改泵的参数。将分析模式选择为二元高压梯度（BGE），并将流速设置为每分钟1毫升。

将泵B的初始浓度设为80%。在3分钟时将流动相梯度调整为80%，在4分钟时调整为85%，从5.5分钟到12分钟调整为100%，在12.1分钟时使泵返回至80%。现在点击柱温箱（Column Oven），并将烘箱温度设置为55摄氏度。然后点击ELSD，将漂移管温度修改为40摄氏度，并保存方法。点击下载（Download）并启动（start up）以开始并平衡仪器。

分别精确称取四种脂质纳米颗粒组分标准物质各10毫克。每种组分分别溶于1毫升甲醇中，并涡旋至完全溶解，得到每种组分浓度为10毫克/毫升的储备液。使用移液器准确吸取各储备液100微升，转移至样品瓶中。

加入600微升甲醇，充分混匀，制备浓度为1000微克/毫升的混合中间溶液一。现在，准确移取20微升每种储备液至样品瓶中。加入920微升甲醇，充分混匀，制备浓度为200微克/毫升的混合中间溶液二。

通过连续稀释法配制一系列不同浓度的标准溶液。接着，使用移液器准确移取100 µL样品至样品瓶中。然后加入900 µL甲醇，充分混匀，以确保脂质纳米颗粒被十倍稀释并从核酸药物中完全解离。

将标准溶液和样品溶液放入液相色谱仪的自动进样器中。在实时分析窗口的辅助工具栏中点击“实时批处理”。接着，在“文件”菜单中点击“新建”以创建新的批处理表。

在批处理表中，输入小瓶编号、托盘名称、数据文件，以及标准品和样品溶液的进样体积。选择已保存的方法文件，然后在“文件”菜单中点击保存批处理文件。等待液相色谱仪压力和色谱图基线稳定。

然后单击助手工具栏中的“开始实时批处理”以启动数据采集。进行数据分析时，打开 LabSolutions 软件的浏览器窗口。将标准溶液数据拖入定量结果视图，以建立校准曲线。

在方法视图中点击“编辑”以修改数据处理参数。在积分参数窗口中，将积分算法更改为 I-PeakFinder，并将基线类型设置为基线到基线。然后，在识别参数中，将识别方法更改为峰带法，并将默认带宽设置为 0.1 分钟。

要修改定量参数，请将定量方法更改为外标法。将校准水平数设置为七个，然后选择校准曲线类型为指数型，并修改化合物设置。

输入四种脂质纳米颗粒组分的名称和标准溶液浓度。双击色谱峰峰顶以更新保留时间。点击“查看”以完成数据处理参数的修改。

现在，将定量结果视图中的样品类型修改为标准计算点。根据标准溶液的浓度，将其水平设置为一至七。校准曲线建立完成后，点击菜单栏中的“文件”（File），保存方法文件。

将样本数据拖入浏览器窗口的定量结果视图中。观察样本中四种脂质纳米颗粒组分的显示浓度结果。LNP标准溶液分析实现了基线分离，四种组分的分离度大于1.5，在高浓度标准溶液中未观察到残留物。

四种组分的校准曲线在5至250微克/毫升的浓度范围内表现出超过0.999的相关系数，表明具有良好的线性关系。该方法重现性高，在六次重复进样10微克/毫升标准溶液的条件下，保留时间的相对标准偏差小于0.1%，峰面积的相对标准偏差小于2%。对实际LNP样品用甲醇稀释10倍后的分析结果显示，各组分浓度范围为150微克/毫升至1,500微克/毫升，在多个生产厂家的样品中均实现了稳定且高效的分离和高灵敏度检测。